肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)相关的CCNF突变已被证明会导致蛋白质稳态失调。CCNF编码细胞周期蛋白F，它是细胞周期蛋白F- e3连接酶复合物SCFcyclinF的一部分，已知其泛素化蛋白酶体降解底物。在这项研究中，我们发现了细胞周期蛋白F调节底物溶解度的功能，并展示了细胞周期蛋白F如何在机制上成为ALS和FTD疾病发病机制的基础。我们证明ALS和ftd相关蛋白sequestoome -1/p62 (p62)是细胞周期蛋白F的典型底物，它被SCFcyclinF复合物泛素化。我们发现SCFcyclin F在赖氨酸(K)281位点泛素化p62，并且K281调控p62的聚集倾向。此外，cyclin F的表达促进p62聚集成不溶性部分，这对应于p62病灶数量的增加。值得注意的是，ALS和ftd相关的突变型细胞周期蛋白F p.S621G异常地泛素化p62，失调p62在神经元样细胞、患者来源的成纤维细胞和诱导多能干细胞中的溶解度，以及失调p62病灶形成。一致地，来自患者脊髓组织的运动神经元显示p62泛素化增加。我们认为，p.S621G突变损害了细胞周期蛋白F促进p62病灶形成和将p62转变为不溶性部分的功能，这可能与细胞周期蛋白F介导的p62泛素化异常突变有关。鉴于p62失调在ALS和FTD谱系中很常见，我们的研究提供了p62调控的见解，并证明ALS和FTD相关的细胞周期蛋白F突变体p.S621G可以驱动与ALS和FTD相关的p62发病机制。
肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)是致命的进行性神经退行性疾病。ALS和FTD表现出临床和遗传重叠，并且越来越多地认识到存在于疾病谱系中。患者可以表现为遗传性(家族性)或散发性ALS和/或FTD。在ALS和FTD中，运动神经元经历进行性细胞死亡，其特征是脑或脊髓中蛋白聚集体的标志性积累[1]。
在ALS和/或FTD患者中，CCNF基因中发现了一些错义突变[2,3]。Cyclin F(由CCNF基因编码)[NM_001761.3, NP_001752.2]是RING finger E3泛素连接酶Skp1-Cul1-F-box复合物(SCF复合物)的底物适配器[4]，其泛素化底物通常被泛素蛋白酶体系统(UPS)降解[5]。Cyclin F是一种786氨基酸的蛋白，具有n端催化F- Box结构域、底物募集Cyclin Box结构域、c端PEST结构域和两个核定位信号[5]。Cyclin Box结构域内有疏水性的309MRYIL313序列(氨基酸Met-Arg-Tyr-Ile-Leu)，对底物结合很重要。该MRYIL序列在各种哺乳动物周期蛋白中都是保守的[6]，并与含有周期蛋白结合(CY)基序(氨基酸Arg-X-Leu/Ile或RxL/I)的底物相互作用(其中X是任何氨基酸)[4,7]。由于细胞周期蛋白F是UPS的组成部分，大多数研究都集中在细胞周期蛋白F介导蛋白酶体降解的机制作用上。
Cyclin F在整个细胞周期中受到严格调控，因此Cyclin F底物主要参与细胞周期进程和维持基因组稳定性。这些底物包括核仁和纺锤体相关蛋白1 (NuSAP1)[8]、细胞分裂周期6 (CDC6)[9]、茎环结合蛋白(SLBP)[10]、核糖核苷酸还原酶M2 (RRM2)[11]、向心圈卷曲蛋白110 (CP110)[7,8]、转录因子(E2Fs)[12,13,14]、核酸外切酶1 (EXO1)[15]、钙粘蛋白1 (Chd1/fzr1)[16]、免疫球蛋白κ J区重组信号结合蛋白(RBPJ)[17]、nad1依赖性蛋白去乙酰化酶sirtuin-5 (SIRT5)[18]。鉴于大多数神经元处于有丝分裂后或G1期，细胞周期蛋白F在神经元、ALS和FTD发病机制中的功能作用尚不清楚。
丝氨酸转甘氨酸突变(p.S621G)是迄今为止研究最多的CCNF突变，因为该突变与疾病的隔代分离良好[2]。我们的团队之前发现，cyclin F p.S621G突变导致其E3泛素连接酶活性增加，用于赖氨酸(K)48连锁多泛素化[19,20,21]，从而导致泛素化的als相关蛋白TDP-43和SCFcyclin F靶蛋白RRM2在神经元细胞中积累[2]。值得注意的是，我们最近报道了突变体p.S621G异常地k48泛素化TDP-43，导致其在神经元中积累;这一异常机制可能导致细胞周期蛋白F p.S195R患者组织中出现束状细胞质TDP-43聚集[22]。最终，突变型cyclin F p.S621G的表达导致其相互作用伙伴的蛋白质稳态改变[22,23]，蛋白质降解系统缺陷[20]，以及细胞死亡途径的激活[21,24]。Cyclin F还与als相关蛋白VCP (valosin-containing protein)[25]和sequestosome-1/p62 (p62)[20,25]相互作用。这些数据强化了细胞周期蛋白F突变(尤其是p.S621G)与ALS和FTD发病机制之间的发病联系[26]。p62是否是E3泛素连接酶SCF细胞周期蛋白F复合物的底物尚不清楚。此外，突变细胞周期蛋白F p.S621G-p62相互作用如何促进ALS和FTD发病机制也不清楚，但可能与缺陷的自噬和蛋白质清除有关[2,20]。
在散发性和家族性ALS和/或FTD病例中，p62水平和p62聚集异常已被证实，包括脑和脊髓中的细胞包体[27,28,29,30]。SQSTM1/p62的遗传关联变异与p62在疾病发病机制中的直接关联，并为p62蛋白平衡改变如何增加神经退行性变的易感性提供了见解[29,31,32,33]。p62是一种多功能蛋白，参与多种信号通路，包括选择性自噬、包涵体形成、蛋白质质量控制和各种细胞信号通路，如抗氧化和抗炎通路，这些信号通路都与ALS和FTD的发病有关[34,35]。p62的多种功能是通过翻译后修饰调控的[36,37,38]。p62的磷酸化调节p62的识别和自噬清除中泛素化底物的捕获[39,40,41,42]。虽然泛素化通常与降解途径有关，但p62的泛素化对其功能产生多种影响。泛素连接酶可以根据泛素化位点抑制或激活p62的功能[43,44,45,46]。研究发现p62泛素化介导基础条件下p62包涵体的形成以促进自噬[46]，这与神经退行性疾病终末期p62阳性病理聚集体不同。然而，突变细胞周期蛋白F的异常泛素化活性如何调节p62仍然未知。
在这项研究中，我们探讨了细胞周期蛋白f介导的p62在ALS和FTD发病机制中的可能作用。我们发现，作为SCF泛素连接酶复合物的一部分，cyclin F通过cyclin Box结构域的MRYIL序列与p62相互作用，并且p62以CY基序依赖的方式被识别。我们报道p62是细胞周期蛋白F的底物，用于SCFcyclin F介导的K281泛素化，这调节了p62的溶解度。Cyclin F的表达也促进p62形成更多的p62病灶，这与不溶性p62的聚集相对应。值得注意的是，ALS和ftd相关的突变细胞周期蛋白F p.S621G异常泛素化p62，减少了不溶性p62的聚集，减少了p62病灶的形成。我们的研究表明E3泛素连接酶SCFcyclin F复合物在p62蛋白停滞中起作用，ALS和ftd相关的cyclin F突变体p.S621G可驱动p62与神经变性相关的发病机制。
Cyclin F和p62在Neuro2A和HEK293T细胞中共同免疫沉淀[20,25]。为了描绘p62中介导与cyclin F相互作用的区域，我们在HEK293细胞中表达了一系列cyclin F缺失突变体，并对不同的cyclin F突变体进行免疫沉淀，以评估它们与内源性p62共同免疫沉淀的能力(图1A和B)。我们发现，cyclin Box结构域n端区域的缺失(?CyclinN)和cyclin Box的缺失(?CyclinBox)破坏了其与p62的结合(图1B)。这表明该区域负责与p62的关联。292-766区域的缺失(?292-766)也减弱了cyclin F与p62的结合，这种减弱被cyclin N结构域的添加(?PEST和?cyclin C)部分逆转。?292-766结构域的结合可以忽略不计，这可能归因于cyclin F缺失结构的产生，该结构将C端区域(氨基酸766-786)的类似氨基酸连接到没有连接区域的cyclin box的缺失氨基酸上。这些结果表明Cyclin Box结构域的n端区域促进了与p62的相互作用。
图1
Cyclin F通过MRYIL序列结合p62。A. mccherry -cyclin F WT和缺失突变体与内源性p62相互作用的示意图。内源性共免疫沉淀p62在免疫印迹上以“+”表示。B.从瞬时表达mCherry-cyclin F WT或缺失突变体(输入)的HEK293细胞制备的裂解物使用RFP Trap磁珠识别cyclin F上的mCherry标签(n=3)进行免疫沉淀，以确定与p62相互作用所需的区域。使用指定抗体进行免疫印迹分析。在与WT c比较之前，将共免疫沉淀p62的量归一化为免疫沉淀mCherry-cyclin F的量。从瞬时表达mCherry-cyclin F的HEK293细胞中制备的裂解物(WT或MRYIL突变体(MR/AA))使用识别cyclin F上mCherry标签的RFP Trap磁珠进行免疫沉淀，然后使用指定的抗体进行免疫印迹分析。内源性p62与cyclin F WT共免疫沉淀，但在cyclin F MR/AA突变洗脱物中减少(n=3)。IP,免疫沉淀反应。核定位信号
Cyclin F中的Cyclin Box结构域包含一个疏水性补丁基序[4,7]。这个疏水氨基酸片段序列MRYIL与其底物中的周期蛋白结合基序相关联[7,11]。接下来，我们研究了p62是否被cyclin F的MRYIL序列识别，因为它位于cyclin Box的n端区域(CyclinN区域)。MRYIL序列的突变先前已被用于鉴定蛋白质相互作用物，如CDC6[9]、B-Myb[47]、RRM2[11]、E2F1[13]、CP110[7]。我们产生了一个mCherry-cyclin F (p.M309A/R310A，简称MR/AA)突变来破坏MRYIL结合序列(309MRYIL/AAYIL313)，并在HEK293细胞中表达细胞周期蛋白F (MR/AA)突变24小时，然后进行共免疫沉淀(图1C)。我们观察到细胞周期蛋白F MR/AA突变体保留了与SCF复合物组分Skp1、Cul1、Rbx1的结合，证实了细胞周期蛋白F MR/AA突变体不破坏SCF复合物的形成，而失去了与内源性p62和已知蛋白相互作用物CDC6的大部分结合[9](图1C)。这证实了cyclin F通过其MRYIL序列识别p62。
Cyclin F通过识别这些底物中的CY基序序列(氨基酸R-X-L/I)与底物结合。值得注意的是p62包含6个推测的CY基序。考虑到cyclin F的MRYIL序列影响其与p62的相互作用，我们假设p62是一个典型的底物，被其CY基序识别。为了验证这一点，我们构建了p62的几个突变体，通过将RxL或RxI位点突变为AxA，每个突变体都缺乏一个CY基序:RxI(18-20)/AxA, RxL(46-48)/AxA, RxL(183-185)/AxA, RxI(312-314)/AxA, RxI(393-395)/AxA, RxL(415-418)/AxA，现在分别称为p62-RxL/AxA 1-6(图2A)。这些构建体在HEK293细胞中与mccherry标记的cyclin F或仅mccherry标记共转染。24 h后，细胞裂解，从细胞裂解液中免疫沉淀ha标记的p62，并用免疫印迹分析。我们发现四个单独的CY基序(RxL/AxA 2-5)的突变破坏了与cyclin F的结合，这表明p62与cyclin F的关联需要一个或多个RxL位点(图2B)。为了证实这种CY基序依赖的相互作用，我们使用相同的裂解液，并使用RFP Trap进行反向IP富集mcherry标记的cyclin F或仅mcherry标记的cyclin F，并对ha标记的p62进行免疫印迹。一致地，我们发现RxL位点的突变破坏了与细胞周期蛋白F的结合(图2B)。结合亲和力的差异可能归因于反向共免疫沉淀仅识别一小部分CY基序突变体。为了进一步证实这些发现，我们在相同的条件下重复了实验，而不是免疫沉淀flag标记的cyclin F，它与每个ha标记的p62 RxL/AxA突变体共表达，确认标签本身不影响底物结合。事实上，我们发现细胞周期蛋白F与p62的相互作用被RxL/AxA突变破坏(图2C)。总之，这些实验证实p62以CY基序依赖的方式与cyclin F相互作用。
图2
p62以CY-motif依赖的方式与cyclin F相互作用。A. HEK293细胞中单个ha标记的p62 CY突变体和WT与细胞周期蛋白F共表达的示意图。p62用磁偶联ha抗体免疫沉淀(IP)，裂解物(输入)和IP用免疫印迹分析。B共免疫沉淀mccherry -cyclin F与p62 CY突变体(n=5)的免疫印迹显示，当四个CY基序单独突变时，cyclin F与p62的共相互作用明显中断(RxL/AxA 2-5)。将co-IP mccherry -cyclin F的量与IP HA-p62的量归一化，以确认由于CY基序2-5 (IP:HA免疫印迹下)而显著丧失共相互作用。反向IP证实p62 CY (RxL)突变体2-5被破坏共相互作用(n=5)。将co-IP HA-p62的量与IP mCherry-cyclin F的量归一化，以确认由于CY基序2-5 (IP:mCherry免疫印迹)而显著丧失共相互作用。C.免疫印迹证实p62 CY突变体(RxL/AxA 2 - 5)破坏了co-IP FLAG-cyclin F (n=2)。免疫印迹结果显示，共免疫沉淀的FLAG-cyclin F归一化为免疫沉淀的HA。注意，不具体
接下来，为了确认内源性细胞周期蛋白F和p62共定位，我们使用了原位邻近连接试验(PLA)，该试验允许检测低丰度蛋白。PLA利用滚环DNA扩增，可以通过荧光标记互补寡核苷酸探针可视化。结果是可以通过荧光显微镜观察到距离< 40 nm的荧光焦点(内源性蛋白质相互作用)[48]。对于聚乳酸分析，荧光焦点的数量使用python脚本计算(https://github.com/doc78/PLA-Analysis)。PLA分析显示细胞周期蛋白F和p62在荧光互补后明确共定位。与单独使用cyclin F或p62抗体相比，细胞中cyclin F和p62染色的荧光灶数量分别显著增加了20倍和4倍(图3A)。cyclin F和CDC6抗体共染色作为阳性对照，因为cyclin F和CDC6是已知的蛋白质相互作用物[9]。与cyclin F和p62抗体共同染色的细胞相比，在cyclin F和CDC6抗体共同染色的细胞上进行PLA产生的病灶数量相似(图3B)。与单独的cyclin F或p62抗体相比，cyclin F和CDC6染色的细胞也检测到更多的病灶。综上所述，这些数据表明内源性cyclin F和p62的共定位距离很近，并与我们之前的结果一起证实了cyclin F和p62是蛋白质相互作用物。
图3
内源性细胞周期蛋白F和p62共定位。A. PLA分析HEK293细胞内源性蛋白相互作用，使用cyclin F和p62联合抗体，cyclin F和cdc6(阳性对照)，cyclin F或p62单独阴性对照，控制IgG或无一抗。红色病灶表示蛋白质相互作用的位点。DAPI核染色(蓝色)。比例尺代表10μm。B.定量每个PLA条件下每个细胞的平均±SEM聚焦数。每个PLA分析中的病灶数量与cyclin F和p62抗体共染色的细胞进行比较，采用Brown-Forsythe不等方差校正的单因素方差分析和Dunnett多重比较事后检验进行统计分析。在技术阴性对照中，即没有一抗染色的细胞，我们观察到病灶数量可以忽略不计(p < 0.005)。单独使用cyclin F或p62抗体进行PLA均产生低数量的病灶(p < 0.0005和p < 0.0005)。仅用小鼠IgG抗体染色，我们观察到的病灶数量可以忽略不计(p < 0.005)。cyclin F-p62相互作用的实验条件用红色表示。**p < 0.005， **p < 0.0005, ns无统计学意义
细胞周期蛋白F在SCFcyclin F泛素连接酶复合体中起底物适配器的作用。因此，我们接下来质疑cyclin F是否调节p62的泛素化。在MG132和氯喹(CQ)存在的情况下，我们在Neuro2A和HEK293细胞中共同表达了his标记的泛素构建物、flag标记的细胞周期蛋白F变体或FLAG-EV以及我们潜在的底物ha标记的p62。值得注意的是，HA标签不包含用于泛素化的赖氨酸位点。为了确认泛素是共价附着在p62上，我们使用带镍的树脂在7 M尿素存在下进行免疫沉淀。我们发现FLAG-cyclin F WT的存在促进了HEK293细胞中p62的泛素化，正如HA信号的高分子量物种所表明的那样(图4A)。Cyclin F LP/AA维持与底物的结合，但导致底物泛素化降低[7,9,22]，与WT相比，EV始终导致p62的泛素化量降低(图4A)。这表明cyclin F调节p62泛素化。
图4
Cyclin F促进p62的泛素化。在HEK293和Neuro2A细胞(输入)中，在MG132和氯喹(CQ)存在的情况下，通过将his标记的泛素构建物与flag标记的细胞周期蛋白F (WT, LP/AA, p.S621G)或FLAG-EV和我们潜在的底物ha标记的p62共表达，进行体内泛素化实验。在变性条件下进行免疫沉淀(IP)。免疫印迹分析显示，A.加入FLAG-cyclin F WT导致HEK293细胞Ni-NTA拉低中HA信号分子量更高，表明p62在cyclin F存在下泛素化(n=3)。定量显示，cyclin F WT表达导致p62泛素化显著增加(顶部面板图)，当p62泛素化水平归一化到FLAG-cyclin F表达水平时(底部面板图)，这一结果是一致的。B.在细胞周期蛋白F p.S621G的存在下，p62在Neuro2A细胞中泛素化程度更高(n=3)。定量显示cyclin F p.S621G的表达导致p62泛素化显著增加(顶部面板图)。当泛素化水平归一化到FLAG-cyclin F表达水平时，p62的泛素化水平略高，但仍然显著(下图)。C.短暂表达mcherry标记的细胞周期蛋白F WT、p.S621G、LP/AA或EV的HEK293细胞进行免疫沉淀，进行体外泛素化实验(n=5)。D.体外泛素化实验采用IP cyclin F WT、p.S621G、LP/AA或mCherry-alone、p62重组片段、E1和E2偶联酶、生物素化泛素，含(+)和不含(-)ATP (n=4)，然后用免疫印迹法分析指示抗体。黑色箭头表示单体(或片段)p62。红色箭头表示p62探测后的细胞周期蛋白F探测，以确认反应中细胞周期蛋白F的缺失或存在，并确认在不同实验条件下免疫沉淀的细胞周期蛋白F的量是一致的。深色涂片和较高分子量带显示p62泛素化形式。乌兰巴托(n), ubiquitylation
为了评估ALS和FTD p.S621G突变对p62泛素化的影响，我们还在Neuro2A细胞中添加了细胞周期蛋白F . s621g进行了泛素化实验。在之前的研究中，我们发现细胞周期蛋白F p.S621G突变导致底物泛素化增加[19,22]。值得注意的是，与WT相比，细胞周期蛋白F p.S621G的存在导致p62的泛素化程度更高(图4B)。在将p62泛素化正常化至FLAG-cyclin F水平后，p62泛素化水平轻微但显著，这可能是由于该实验中使用的短暂共表达。总之，这些数据表明细胞周期蛋白F p.S621G导致细胞培养中p62的异常泛素化。
接下来，我们研究了p62是否是SCFcyclin F的泛素化底物，通过结合体外所需的所有成分的体外泛素化实验。在本实验中，我们还研究了细胞周期蛋白F p.S621G ALS和FTD变体对细胞周期蛋白F泛素化p62能力的影响。从细胞裂解物中免疫沉淀mccherry -cyclin F变异体，以确保SCF复合物的完整，从而保持其与mccherry -标签的酶活性[19]。纯化后的重组蛋白p62与生物素化泛素和免疫沉淀的细胞周期蛋白F在E1 (UBA1)和E2 (UBE2D3)偶联酶存在下(含和不含ATP)孵育，免疫印迹分析。所使用的重组p62是含有p62的85-422氨基酸的市售片段，它包含17个已知泛素化位点中的15个。
细胞周期蛋白F WT、ALS和FTD突变体p.S621G和LP/AA的免疫沉淀证实了与p62的相互作用，而EV单独没有观察到这种相互作用(图4C)。Skp1、Cul1和Rbx1都与细胞周期蛋白F WT和p.S621G共同免疫沉淀，这表明SCF复合物在体外泛素化实验中是完整的，而LP/AA变体与Skp1的结合减少了(图4C)。我们的结果表明重组p62作为SCFcyclin F复合物的一部分被细胞周期蛋白F泛素化(图4D)。与WT相比，Cyclin F LP/AA一致导致p62的泛素化程度较低，并且在没有ATP的情况下，我们没有检测到p62的泛素化活性。与此一致的是，引起ALS和FTD疾病的细胞周期蛋白F p.S621G变异异常地泛素化p62(图4D)。总之，这些结果证实p62是SCFcyclin F的泛素化底物，并且细胞周期蛋白F p.S621G异常地泛素化p62。
为了在患者组织中进行验证，我们对细胞周期蛋白F突变(p.S621G和p.S195R)患者和对照组的死后脊髓组织进行了免疫荧光分析。鉴于我们之前证明了cyclin F p.S195R突变导致SCFcyclin fe3泛素化活性显著增加[21]，并且其过表达导致泛素化底物的积累[2]，我们假设p62的异常泛素化也可能发生在cyclin F p.S195R突变的患者中，并对p.S195R死后脊髓组织进行了免疫荧光分析。如图5所示，我们发现在所有cyclin F患者组织中p62和泛素均呈强阳性的大神经元包涵体，但在对照组中没有。在cyclin F患者中，我们观察到p62包裹体在很大程度上被定位到泛素中，但泛素包裹体不一定对p62呈阳性。因此，我们发现，与对照组相比，泛素在患者组织中与p62的共定位明显更多(Dunnett多重比较Pearson相关检验的方差分析，p. s621g和p. s195r组织的p < 0.0001)，表明在细胞周期蛋白f相关的患者组织中，p62在疾病晚期高度泛素化。
图5
p62在细胞周期蛋白F患者死后脊髓运动神经元中高泛素化。a .来自对照健康运动神经元的p62(绿色)和泛素(红色)的免疫荧光，或来自细胞周期蛋白F患者脊髓组织切片的退化运动神经元。放大图为p62与泛素染色正交图。B.通过Fiji Image J共定位分析插件BIOP JaCoP获得p62和泛素包涵的区域。与对照组相比，Cyclin F p.S621G和p.S195R患者的泛素和p62共定位明显增加，提示p62高泛素化。白色比例尺。****p < 0.0001
为了鉴定细胞周期蛋白f介导的p62上的泛素化位点，我们用质谱(MS)分析了体外泛素化检测[49]。我们发现，在先前报道的泛素化位点K281处，p62被所有cyclin F变异体泛素化[50]，而在空载体对照中没有泛素化(图6A和B)。此外，对包含泛素化位点(氨基酸241-318)的p62区域的蛋白质序列分析表明，K281位点在物种中是保守的(图6C)。
图6
细胞周期蛋白F使p62的赖氨酸281泛素化。A. HEK293细胞免疫沉淀细胞周期蛋白F对重组蛋白p62体外泛素化的质谱分析表明赖氨酸281被泛素化。含有泛素加合物的c端赖氨酸(K) 281的相应p62肽268LTPVSPESSSTEEK281的质谱图。B.细胞周期蛋白f介导的p62上K281泛素化位点示意图。C. Cyclin F在体外保守的K281位点泛素化重组p62
接下来，我们确定K281泛素化是否影响p62聚集，因为在家族性和散发性ALS和FTD病例的脑和脊髓组织中都发现了p62和泛素阳性的病理聚集物[27,34]。我们研究了p62泛素化位点K281是否会改变其在运动神经元样NSC-34细胞中的溶解度，方法是用mc樱桃细胞周期蛋白F表达ha标记的抗泛素化但化学性质相似的p62突变体(赖氨酸281精氨酸点突变，K281R)，并进行可溶性和不溶性分离实验。对于每个重复，对这些片段进行免疫印迹，并将蛋白质水平归一化为β-肌动蛋白负载对照(图7)。与WT表达细胞相比，K281R突变体中可溶与不溶p62的比例显著增加(p < 0.005)(图7)。这一数据表明，K281中p62泛素化的缺失减少了p62向不溶部分的转移。
图7
细胞周期蛋白f介导的泛素化位点K281调节p62的溶解度。A.收集瞬时共表达ha标记的p62 WT或K281R突变体与mccherry标记的cyclin F的组合的NSC-34细胞。一部分细胞颗粒直接在尿素缓冲液中裂解得到总蛋白，剩余的细胞颗粒在RIPA缓冲液中裂解得到可溶部分，RIPA不溶性颗粒在7 M尿素缓冲液中溶解得到不溶部分。对裂解物进行免疫印迹分析，检测p62、细胞周期蛋白F或β-肌动蛋白的量，作为负载控制(n=4)。与WT p62相比，K281R可溶与不溶p62的比例显著增加。对同一免疫印迹进行重复分析进行比较。具有代表性的免疫印迹用虚线表示来自同一免疫印迹的裁剪图像。数据为平均值±SEM (n=4)。**p < 0.005, ns不显著，ns非特异性
为了确定ALS和ftd相关的变异体细胞周期蛋白F对内源性p62溶解度的影响，我们将神经元样Neuro2A细胞裂解物分离成RIPA可溶性和不溶性部分。对于每个重复，对ripa可溶性和不溶性部分进行免疫印迹，并将蛋白质水平归一化为β-肌动蛋白负载对照。我们首先评估了细胞周期蛋白F (WT和结合突变体MR/AA)对p62溶解度的影响。与单独转染mccherry的Neuro2A细胞相比，cyclin F WT中可溶性与不可溶性p62的比例显著降低了20% (p < 0.005)，但在表达cyclin F MR/AA的细胞中没有(图8A)。这些数据表明，cyclin F的表达通过将p62转移到不溶性部分来促进p62的不溶性。
图8
表达cyclin F WT、p.S621G、MR/AA和EV的Neuro2A细胞、症状性的CCNF p.S621G患者成纤维细胞和CCNF p.S621G患者iPSC在RIPA缓冲液中裂解获得可溶部分，将RIPA不溶性颗粒溶解在7 M尿素缓冲液中获得不溶部分。对裂解物进行免疫印迹分析，检测p62、细胞周期蛋白F或β-肌动蛋白的量，以进行负荷控制归一化(n=3)。A.将WT和MR/AA表达的细胞裂解物与EV转染的细胞裂解物进行比较，以确定cyclin F表达对p62溶解度的影响。然后将表达Cyclin F p.S621G的细胞裂解物与表达WT的细胞裂解物进行比较，以确定p.S621G突变对p62溶解度的影响。B.与对照组相比，症状性CCNF p.S621G患者成纤维细胞中可溶性与不可溶性p62比值增加。C.与等基因对照组相比，CCNF p.S621G患者来源的iPSC中可溶性与不可溶性p62比值增加。数据为平均值±SEM (n=3)。* * * p < 0.05, p < 0.005, * * p < 0.0005, ns不显著,n。非特异性
为了评估细胞周期蛋白F的p.S621G突变形式的影响，我们接下来比较了p62在表达细胞周期蛋白F WT的细胞中的溶解度。因此，在cyclin F p. s621g表达的细胞中，与cyclin F WT相比，可溶性与不可溶性p62的比例显著增加了38% (p < 0.05)(图8A)。这些数据表明，突变型cyclin F p.S621G的表达降低了内源性p62向不溶性部分转移的倾向。为了验证cyclin F p.S621G是否在ALS和FTD患者来源的细胞中导致p62溶解度缺陷，我们在非疾病对照和症状性ALS和FTD影响的CCNF p.S621G患者的人类原代成纤维细胞培养中重复了可溶性-不溶性蛋白分析。我们还研究了p62在来自CCNF p.S621G患者的诱导多能干细胞(iPSC)中的溶解度，并与在技术重复中培养的等基因对照进行了比较[51]。根据对Neuro2A细胞的观察，与来自非疾病对照患者的成纤维细胞相比，ALS和FTD患者成纤维细胞中可溶性p62与不可溶性p62的比例显著更高(p < 0.0005)(图8B)。与等基因对照相比，ALS和FTD患者的iPSC中可溶性p62与不可溶性p62的比例增加(p < 0.005)(图8C)。因此，在细胞周期蛋白F p.S621G突变患者的人原代成纤维细胞和iPSC中重现了可溶性与不可溶性p62比例的增加，表明突变的细胞周期蛋白F异常地影响了p62在疾病发病机制中的溶解度。
鉴于cyclin F的表达促进了p62向不溶性部分的转移，我们质疑这与p62灶和聚集体的形成有何关系。在表达mcherry标记的细胞周期蛋白F (WT, p.S621G, MR/AA)或单独表达mcherry的HEK293细胞中，用免疫荧光法评估p62。有趣的是，我们在表达cyclin fwt的细胞中观察到明显的p62灶。在至少30个细胞的3个生物重复中，定量内源性p62灶的大小(面积)和数量。各组之间p62病灶的相对面积均无显著差异(图9B)。然而，与单独的mcherry和cyclin F MR/AA对照结构相比，表达cyclin F WT的细胞每个细胞的p62病灶数量显著增加(p < 0.0001)(图9C)。为了确定p.S621G突变的影响，比较了WT和p.S621G结构。值得注意的是，ALS和FTD突变型cyclin F p. s621g与cyclin F WT相比，每个细胞的p62病灶明显减少(p < 0.0001)。这支持了我们之前的发现，即表达cyclin F WT而不是突变体p.S621G促进了p62聚集成不溶性部分的倾向，并证明了ALS和FTD相关的cyclin F变体破坏了p62灶的形成。总之，这些数据表明这些p62病灶是不溶性的，并且不一定与疾病发病机制中的病理聚集有关，因为它们在WT中比突变的周期蛋白F细胞中观察到更多。
图9
Cyclin F WT而不是突变体p.S621G促进p62灶的形成。A.短暂表达mcherry标记的细胞周期蛋白F (WT, p.S621G, MR/AA)和mcherry -单独表达的HEK293细胞的免疫荧光检测p62灶(白色箭头)，使用CellProfiler分析。B.对p62病灶的相对大小(面积)进行量化，并与单独的mcherry结构进行比较。C. Cyclin F WT表达细胞的p62病灶数量明显高于mcherry单表达细胞，而p.S621G表达细胞的p62病灶数量明显高于mcherry单表达细胞。只有转染的细胞被纳入分析(红色通道)，在分析后进行调整，以供演示和发表。白色箭头表示转染细胞的病灶。****p < 0.0001
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在目前的研究中，我们发现了一种E3连接酶，SCFcyclin F，它在K281位点泛素化p62，调节p62向不溶性部分的转变。我们的数据表明，cyclin F的表达导致p62聚集成不溶性部分，这与p62病灶数量的增加有关。值得注意的是，该研究进一步证明了UPS和自噬这两种主要蛋白质清除途径之间的复杂相互作用[36,52,53,54]，表明cyclin F(已被报道为蛋白酶体降解的泛素底物)也可以影响关键自噬相关蛋白p62的溶解度。我们还鉴定并探索了ALS和ftd相关的突变细胞周期蛋白F p.S621G的病理生物学。值得注意的是，我们证明了ALS和ftd相关的突变体细胞周期蛋白F p.S621G影响p62泛素化，破坏了细胞周期蛋白F调节的p62病灶形成和聚集。这表明细胞周期蛋白F的功能异常(由ALS和FTD相关突变或其他缺陷引起)导致p62稳态失调，这可能是ALS和FTD发病的潜在机制。
迄今为止，很少有E3连接酶介导p62泛素化的报道，并且没有一个影响p62在ALS发病机制中的功能。我们现在已经证明cyclin F通常通过其底物识别基序(309MRYIL313)识别p62，并且p62以cy依赖的方式结合，已知其被MRYIL基序识别[6,55]。我们之前证明突变体SCFcyclin F具有升高的E3连接酶活性[19,20,21]，Lee等人在Neuro2A细胞中报道的共免疫沉淀实验表明，突变体cyclin F p.S621G比cyclin F WT与p62的相互作用更多[20]。与细胞周期蛋白fwt相比，我们的体外和细胞培养泛素化实验显示突变型细胞周期蛋白F异常泛素化p62。我们的研究结果表明，泛素连接酶活性的升高以及突变细胞周期蛋白F与p62相互作用的增加有助于p62泛素化的增加。
P62是一种多功能支架蛋白，参与多种信号通路，包括选择性自噬、包涵体形成、蛋白质质量控制和各种细胞信号通路，如抗氧化和抗炎通路[34,35]。这些关键功能依赖于p62的构象变化，这些构象变化是由泛素化等翻译后修饰调节的。表达突变cyclin F的细胞经历泛素应激(赖氨酸(K) 48相关的泛素水平升高)和缺陷的自噬[2,20]。从这个角度来看，p62的泛素化破坏了p62的UBA结构域的二聚化，使其能够识别多泛素化的产物进行自噬[56]，这是泛素应激条件下的关键机制。结合之前的文献，我们在这里提出的数据支持突变细胞周期蛋白F异常的p62泛素化可能会干扰其功能，如自噬。虽然突变型细胞周期蛋白F对p62泛素化的改变在细胞系中是温和的，但这些异常变化可能是疾病发病较晚的原因，如在ALS和FTD中所见[57,58,59]，导致与对照组相比，在疾病末期患者脊髓运动神经元中观察到p62泛素化的显著增加。有趣的是，p62泛素化失调不仅局限于ALS和FTD，而且在帕金森病发病机制中也被发现，突变型帕金森氏蛋白失调p62蛋白酶体转换[60]，支持p62泛素化失调在神经退行性疾病发病机制中起关键作用的观点。
虽然最近的一项研究没有发现p62被cyclin F泛素化，但通过diGly蛋白质组学检测到表达cyclin F的细胞中泛素化的p62[61]，我们认为这是由于蛋白质静止的扰动触发了清除p62的蛋白质降解途径的激活。在目前的研究中，蛋白酶体和自噬抑制剂被用来阻止检测前对泛素化p62的清除。此外，本研究中的体外泛素化实验提供了一个孤立的环境来证实p62泛素化。与细胞系相比，死后患者组织中p62泛素化的差异更为明显。瞬时表达用于培养中泛素化实验，这可能只代表泛素化p62的一个群体。细胞周期蛋白F患者神经元的单细胞分析更能反映细胞周期蛋白F突变对p62泛素化的影响，尤其是在疾病终末期。
p62可被E3泛素连接酶parkin或cullin-3泛素化，用于蛋白酶体的周转[60,62]。在Song等人的研究中，parkin主要通过k48连接的泛素链介导p62的多泛素化，K63泛素修饰较少发生[60]。在我们研究的体外泛素化实验中，cyclin F可能利用WT单泛素部分介导不同泛素连接和结构的连接;这还有待探索。E3连接酶trim21介导p62的k63泛素化，以消除p62的寡聚和蛋白质的隔离，以实现p62调节的氧化还原稳态[63,64]。此外，E3连接酶NEDD4调节包涵体的形成和随后的自噬[46]。虽然周期蛋白F通常是k48泛素化蛋白来清除UPS，但很明显E3连接酶介导的p62泛素化促进和调节蛋白酶体转换以外的功能。在这项研究中，我们发现了细胞周期蛋白F在p62上泛素化K281并促进其不溶性聚集的“非规范”作用，这与p62病灶数量的增加相对应。
聚集体的形成是细胞保护还是细胞毒性导致神经元死亡一直存在争议[65]。这两个概念可能都是正确的，这取决于疾病的阶段和潜在的家族突变的存在。p62在具有TDP-43和polyQ蛋白等致病蛋白毒性的神经退行性疾病中发挥保护作用，这种保护作用依赖于p62的寡聚物种类和自噬降解[66]。自噬清除这些聚集体的主流观点是，k63 -泛素标记的蛋白质被p62和其他自噬调节蛋白组装成聚集体，然后被自噬体吞噬降解[67]。事实上，p62动力学在聚集形成之前的步骤中起着关键作用。自噬的早期阶段需要p62聚合并形成p62小体[68]，或胞质p62包涵体，然后包涵体招募k63连接的多泛素链并进行p62相分离[69]。我们的实验显示免疫荧光可见p62灶和低水平的不溶性p62独立于cyclin F的表达。这与有报道称p62自聚集[70]，包括形成纤维状聚集体[71]，以及p62可以通过其PB1结构域进行自寡聚[38,72]相一致。有趣的是，cyclin F WT的表达促进p62聚集成不溶性部分，这对应于每个细胞中p62病灶数量的增加。考虑到p62的磷酸化调节p62小体的形成[69]，这些结果表明细胞周期蛋白F介导的泛素化可能是另一种调节p62病灶形成的翻译后修饰。此外，E3连接酶NEDD4与p62相互作用，调节包涵体形成和随后的自噬[46]。细胞周期蛋白f介导的p62泛素化可能调控p62病灶的形成，作为自噬的前一步，这需要进一步的研究。
值得注意的是，这项研究利用表达细胞周期蛋白F或p62变体的细胞系来阐明蛋白质相互作用的机制功能，并且研究结果在疾病相关组织中得到了概括。对于p62的溶解度，本研究的重点是考虑到细胞周期蛋白f介导的泛素化位点K281在调节p62溶解度中的作用，p62聚集成不溶性部分的倾向。虽然我们观察到神经元样的Neuro2A细胞在表达细胞周期蛋白F的裂解物中具有相似的总p62水平，但我们观察到患者来源的成纤维细胞和iPSC具有不同水平的总p62。这可能是由于与细胞系相比，成纤维细胞和iPSC在培养中可维持数周或数月，这与先前比较细胞系和患者来源细胞的发现一致[20]。值得注意的是，突变体周期蛋白F p.S621G异常泛素化p62，并没有促进p62聚集成不溶性部分或形成更多的p62灶。相反，与表达cyclin F WT的细胞相比，p62病灶的数量显著减少，并且与cyclin F MR/AA和mcherry单独构建的细胞相似。出乎意料的是，这些发现表明p62灶是不溶性的，而不溶性p62灶的缺失有助于疾病的发病机制。这些发现可能是突变周期蛋白f异常泛素化的结果，值得注意的是，这与不溶性p62是病理基础指示的典型观念相反。我们的发现可能是早期疾病发病机制的基础，p62溶解度的差异可能发生在整个疾病阶段或病理过程中。考虑到早期自噬阶段需要p62小体[68]，我们推测突变的周期蛋白F阻碍了p62形成病灶的能力，从而导致了在表达p.S621G的神经元样细胞和含有p.S621G突变的患者成纤维细胞中报道的潜在自噬缺陷[20]。众所周知，自噬清除了与ALS和FTD相关的蛋白质，我们的研究结果暗示了ALS和FTD发病机制失调的早期机制。未来抑制自噬途径的研究可以证实突变型cyclin F是否由于p62病灶的形成和聚集被破坏而起致病作用。
家族性和散发性ALS和FTD中CCNF的致病基因变异与ALS和FTD相关蛋白如TDP-43[22]、SFPQ[23]、VCP[25]以及间接的p62[20]的失调有关。我们的研究小组最近发现突变体cyclin F p.S621G异常地使als相关蛋白TDP-43泛素化[22]，现在又发现cyclin F p.S621G也异常地泛素化和失调p62。由于p62水平的升高改变了TDP-43的动态，阐明细胞周期蛋白f介导的p62泛素化是否也有助于TDP-43的病理变化也是很有趣的[73]。
p62汇集了多种ALS和ftd相关的信号通路和蛋白质(如最近在[34]中所述)。因此，突变细胞周期蛋白F对p62的异常调节可能通过多种机制促进神经元毒性。例如，我们的研究小组报道了突变的cyclin F在细胞和斑马鱼中引发神经元凋亡[21]。此外，有研究表明，干扰p62功能会增加亨廷顿病发病过程中的细胞死亡[68]。因此，未来关于细胞周期蛋白f介导的泛素化是否会破坏p62在与ALS和FTD发病机制相关的凋亡通路中的功能的研究需要进一步研究。
总的来说，我们的研究表明p62是cyclin F的一个新的底物。我们提供了cyclin F和p62调控之间的机制联系，对ALS和FTD的发病机制有影响。重要的是，我们发现突变型细胞周期蛋白F p.S621G异常泛素化p62，导致p62病灶形成减少和溶解度异常，这些事件与包括ALS和FTD在内的神经退行性疾病有关。总之，我们的研究结果表明，与ALS和FTD相关的细胞周期蛋白F突变可导致p62失调，支持p62异常介导的蛋白质清除或细胞死亡途径的调节可能是ALS和FTD发病机制的基础。
本研究中使用的市售抗体见补充表1，并附有相应的实验稀释度和目录编号。
如前所述，使用编码野生型和p.S621G CCNF cDNA融合到n端mCherry荧光团的表达构建[2]。将MR/AA (M309A/R310A)和LP/AA (L35A/P36A) CCNF突变体亚克隆到pmCherry-C1载体中。与n端flag标签融合的野生型CCNF cDNA也被克隆到pcDNA3.1载体(Genscript)中。
创建CCNF缺失(?)构建物(?PEST，氨基酸?582-766;?CyclinBox，氨基酸?292-528;?CyclinN，氨基酸?292-405;?CyclinC，氨基酸?408-528;(292-766，氨基酸?292-766)，含有n端mCherry荧光团，首先将CCNF cDNA插入pGEM-T载体，然后亚克隆CCNF缺失片段pmCherry-C1载体。验证PCR表明，所有缺失片段都成功克隆到pmCherry-C1载体上。对CCNF缺失区域两侧核苷酸的测序证实了预期的序列。
将融合到n端ha标签的野生型SQSTM1/p62 cDNA克隆到pcDNA3.1载体中，该载体也用于诱变以创建p62 RxL/AxA构建体(Genscript)。pCI-His-hUbi是Astar Winoto (Addgene质粒# 31815;http://n2t.net/addgene: 31815;RRID: Addgene_31815)[74]。
HEK293、Neuro2A、NSC-43细胞和成纤维细胞在添加10% (v/v)胎牛血清(FBS, Sigma-Alrich)的DMEM中生长，并按先前描述的方法维持[20,22,75,76]。如前所述[51]，维持诱导多能干细胞。细胞保存在培养箱中(37℃，5% CO2, 95%湿度)。使用Mycoalert支原体检测试剂盒(Lonza)对所有细胞系进行常规支原体检测。将细胞收获到加入1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)和1X磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Roche)的冰冷NP-40裂解缓冲液中。
所有瞬时转染均采用Lipofectamine2000 (Thermo Fisher Scientific)，按照制造商协议进行。在12个孔和T75烧瓶中分别转染了总计0.6μg或7μg的DNA。通过免疫印迹或免疫荧光分析评估蛋白表达。
用蛋白酶体抑制剂MG132(5μM, Selleckchem)和自噬抑制剂氯喹(CQ)(100μM, 7 h, Selleckchem)处理HEK293细胞，进行体内泛素化实验。药物治疗的对照包括DMSO(媒介物)孵育。我们将表达cyclin F、p62和ubiquitin的细胞瞬时置于MG132和CQ中24小时。然后将细胞溶解在含有1X蛋白酶抑制剂混合物和1X磷酸酶抑制剂混合物的尿素裂解缓冲液中，在变性条件下进行免疫印迹分析和免疫沉淀。
将细胞刮入冰冷的PBS中。用冰冷的PBS冲洗三次烧瓶，每次冲洗都加到收集的细胞中。1000xg, 4℃离心5min，收集细胞颗粒。丢弃上清。小球在冰上孵化20分钟在NP-40裂解缓冲(Tris-HCl NP-40 1%, 50毫米,150毫米氯化钠,EDTA 2毫米,10毫米NEM),里帕裂解缓冲(Tris-HCl NP-40署0.25%,1%,50毫米,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米),或尿素溶解缓冲区(7 M尿素,2 M硫脲,4%的皮套裤,30毫米三)补充与x 1 x蛋白酶和磷酸酶抑制剂间歇涡流与声波Ruptor声波降解法之前,250年在50%功率和脉冲发生器设置设置为30%,每10个脉冲。在4°C下，14000xg离心15分钟。收集含有细胞蛋白的上清液，评估蛋白浓度并用于实验。
根据制造商的方案，使用多链接原位邻近连接试验(PLA) [48] (Sigma-Aldrich)。为了制备用于聚乳酸分析的HEK293细胞，将细胞在12孔板的盖片上同步生长至约50-70%的合流度，在4%多聚甲醛(PFA)的PBS中固定20分钟，并用PBS冲洗3次。然后用0.2% Triton X-100在PBS中渗透20分钟，用Duolink PLA阻断缓冲液阻断细胞，然后用抗cyclin F(小鼠)、抗p62(兔)或抗cdc6(兔)的一抗孵育，然后进行PLA分析，制备荧光显微镜，使用Texas Red滤光片(蔡司)成像。在识别一抗后，含有独特DNA链的二抗(PLA探针)在近距离(< 40 nm)杂交形成环状DNA。PLA利用滚环DNA扩增，可以通过荧光标记互补寡核苷酸探针可视化。其结果是可以通过荧光显微镜观察到邻近点的荧光焦点(内源性蛋白质相互作用)[48]。
一抗室温孵育1小时。然后在37℃下加入PLA探针(兔和小鼠)1 h，然后在37℃下结扎30 min，在37℃下扩增100 min。用带DAPI (Thermo Fisher Scientific)的extend Gold Antifade Mountant将盖片安装在载玻片上，使用Texas红色滤光片进行荧光显微镜成像，以显示红色荧光PLA焦点。阴性技术控制包括遗漏所有一抗(仅二抗PLA Probes)和单独遗漏每个一抗(仅抗cyclin F，仅抗p62)。阴性生物对照包括IgG对照，阳性生物对照包括已知的细胞周期蛋白F蛋白相互作用物cdc6(抗细胞周期蛋白F与抗cdc6)。重复三次生物重复，将平均值与仅cyclin F和仅p62对照进行比较。使用python脚本(https://github.com/doc78/PLA-Analysis)对PLA焦点进行量化，使用流水线对图像进行预处理，然后使用Watershed算法获得最终分割。简单地说，将图像转换为黑白，用白色像素代表荧光红色焦点，然后勾画出白点(焦点)并进行量化。通过随机选择的图像计数来确定病灶计数。
用4%多聚甲醛(PFA)在PBS中固定细胞20分钟，用PBS冲洗3次。然后用0.2% Triton X-100在PBS中渗透20分钟，然后用1% BSA, 22.52 mg/mL甘氨酸在0.1% Triton X-100中阻断30分钟。抗体用PBS- t (PBS-吐温20,0.05%)和2% NGS稀释。加入一抗，在室温下孵育2小时。盖片用PBS轻轻洗涤三次，共15分钟，然后在室温下黑暗中与二抗孵育1小时。二抗小鼠AlexaFluor488稀释为1:200，用于检测p62。使用带DAPI (Thermo Fisher Scientific)的extend Gold Antifade Mountant将盖片安装在玻片上。使用蔡司荧光显微镜观察染色和荧光标记。特异性对照包括无一抗的二抗染色(数据未显示)。用至少30个细胞完成了3次生物重复。使用CellProfiler分析仅mCherry-cyclin F或单独转染mcherry的细胞中的P62灶。
为了进行免疫沉淀，HEK293和Neuro2A细胞在加入1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1X磷酸酶抑制剂鸡尾酒的冰冷NP-40裂解缓冲液中裂解。重悬的细胞在冰上冷冻15分钟，间歇涡旋(3x)，然后使用Sonic Ruptor 250在50%功率和30%脉冲设置下进行10次超声，并在14000xg离心20分钟以去除细胞碎片。使用Pierce?BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)估计蛋白浓度。免疫沉淀使用约500μg细胞蛋白和20μL RFP-Trap?磁珠(Chromotek)识别mccherry标签，或根据制造商说明使用抗ha磁偶联珠(Pierce, Thermo Fisher Scientific)识别ha标签。对于共免疫沉淀实验，非特异性结合对照包括用转染mCherry-tag或pcDNA3.1空载体(EV)的裂解液孵育微球，以及仅用NP-40裂解缓冲液孵育(而不是裂解液)。用磁铁收集磁珠，在NP-40裂解缓冲液中洗涤三次。洗脱，加入2X样品缓冲液，95℃煮沸10 min，免疫印迹分析。
SCFcyclin f介导的p62泛素化是用体外泛素化法测定的。HEK293细胞瞬时转染mCherry标记的Cyclin F WT, ALS和ftd突变体p.S621G，活性降低突变体(L35A/P36A，简称LP/AA)，或使用Lipofectamine 2000单独转染mCherry标签，根据制造商说明。细胞在含有1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1X磷酸酶抑制剂鸡尾酒的NP-40裂解缓冲液中裂解。按照之前的免疫沉淀方案，使用RFP Trap磁珠对mCherry标记的Cyclin F进行免疫沉淀(500μg)，以确保SCF复合物(Skp1, Cul1, Rbx1)的拉下。免疫印迹证实SCF复合物是完整的，适合用于体外泛素化分析。作为对照，F- box突变体Cyclin F (L35P/A36A)作为催化失活对照，不与SCF复合体中的Skp1结合，但仍与其底物结合，因此LP/AA突变体无法促进泛素化[9,12]。在Cyclin F泛素化研究中，LP/AA突变体已被用作适当的对照，D 'Angiolella等人首次证明了这一点[7]，我们证实了我们实验室生成的LP/AA构建体与本研究中使用的构建体是一致的[22,23]。
为了评估细胞周期蛋白F对p62的泛素化状态，免疫沉淀的细胞周期蛋白F在NP-40裂解缓冲液中洗涤三次，然后在泛素化实验缓冲液(100 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT, pH 8.0)中洗涤两次。体外实验在50μL的体积中进行，其中含有5μg his标记的重组人SQSTM1/p62蛋白(ab95320, abcam)， 10 nM E1 (UBA1;BML-UW9410, Enzo Life Sciences)和100 nM E2 (UBE2D3;UB-42899, Life Sensors)偶联酶，10μg/mL生物素化标记的泛素(BML-UW8705, Enzo Life Sciences)，加或不加1.6 mM ATP，室温下搅拌(800 rpm)孵育2小时。一半的样本进行免疫印迹分析。重组p62蛋白为氨基酸85 ~ 440的蛋白片段。这是由于没有完整的重组p62蛋白。
将表达FLAG-cyclin F、HA-p62和His-ubiquitin[74]构建体的HEK293和Neuro2A细胞在变性尿素裂解缓冲液中裂解24 h。在室温下，用50%的Ni-NTA树脂琼脂糖珠在变性条件下免疫沉淀泛素化蛋白30分钟。样品在15,000xg下离心10 s，丢弃上清。用尿素裂解缓冲液(pH 6.3)洗涤树脂2次。这样重复了三次。用尿素裂解缓冲液(pH 4.5)将泛素化蛋白从球珠中洗脱出来，在15,000xg下离心10 s。将上清液收集到一个新管中。重复三次，并将上清混合。完成3次生物重复。免疫印迹分析测定泛素化状态。
瞬时转染表达cyclin F变异体的Neuro2A细胞，用冷冻PBS洗涤3次，离心收集细胞颗粒。用DMSO处理细胞进行药物治疗比较研究。将Neuro2A细胞、患者成纤维细胞和iPSC的细胞颗粒重悬在含有1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1X磷酸酶抑制剂鸡尾酒的200-300μL冰冷的RIPA缓冲液中。重悬细胞在冰上冷冻15分钟，间歇涡旋(3x)，然后使用Sonic Ruptor 250在50%功率下进行10次超声，脉冲器设置为30%。裂解液在4℃下，100,000xg超离心30分钟(Beckman Coulter)。所得上清作为ripa可溶部分收集。剩余颗粒用RIPA缓冲液洗涤3次，在RIPA缓冲液中重悬，然后重复超声和超离心。该步骤重复3次，以去除尽可能多的RIPA可溶性蛋白。丢弃上清，将颗粒重悬于50-100μL尿素缓冲液(7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS, 30 mM Tris)中，进行相同的超声和超离心。收集的上清为尿素溶性，代表ripa不溶性部分。然后进行免疫印迹分析。
使用Pierce?BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)估计蛋白浓度。使用4-15% Tris-Glycine (Bio-Rad)预制SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质，使用Tris-Glycine - sds缓冲液，通常含有10μg蛋白质。使用Bio-Rad Trans-blot Turbo Transfer System (1.3 a, 25 V, 10 min)将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。膜在奥德赛?阻断缓冲液(LI-COR)中在TBS中阻断1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜或在室温(RT)下孵育1小时。膜用TBS-T洗涤3倍，洗涤15分钟，然后在室温下加入荧光标记的IRDye?680RD山羊抗兔或IRDye?800CW山羊抗小鼠IgG二抗(1:10 000,LI-COR)各30分钟。在进行比较之前，使用抗β-actin抗体将感兴趣的蛋白归一化。免疫印迹分别使用LI-COR Odyssey CLx成像系统在700 nm和800 nm波长下成像，并通过LI-COR分析软件进行定量。
LC-MS /MS分析按照最近的描述[21]进行，略有修改。
样品经SDS-PAGE凝胶电泳(BioRad)分离，用10 mM DTT进行凝胶内还原，用20 mM IAA进行烷基化，并在37°C (V5111, Promega)下进行胰酶消化(酶:蛋白比例1:50)过夜。提取的肽被冻干，然后在0.1%甲酸(FA)中重悬，用C18 OMIX尖端(A57003100K, Agilent)脱盐。样品再次冻干，在0.1% FA中重悬，浴声20 min, 14000xg离心15 min，去除不溶性杂物，上清液(澄清肽)装瓶，LC-MS /MS分析。
使用Ultimate 3000 nanoLC (Thermo Fisher Scientific)，配合Acclaim PepMap RSLC柱粒径为2 μm，直径为0.075 mm，长度为150 mm (Thermo Fisher Scientific)，采用60 min梯度(2 - 80% v/v ACN, 0.1% v/v FA)，流速为300 nl/min分离多肽。随后，洗脱的肽被电离到Q Exactive Plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific)中，该质谱仪具有一个电喷雾源，其发射器尖端为10 μm (New Objective)，并保持在1.6 kV的电喷雾电压。毛细管温度设置为250°C。采用数据依赖的“Top 10”方法，在FT采集模式下使用HCD碎片进行MS/MS碎片选择前体离子。在Q Exactive Plus上，以7万分辨率进行FT-MS分析，全质谱下AGC目标为1 × 106个离子，最大进样时间为30 MS;MS/MS扫描在17500分辨率下进行，AGC靶为2 × 104离子，最大注射时间为50 MS。离子选择阈值设置为25,000个计数，以触发MS/MS碎片。采用隔离宽度为2.0 Da，归一化碰撞能量为27进行HCD碎片化。
原始文件使用Proteome Discoverer 2.4 (Thermo Fisher Scientific)对Uniprot FASTA数据库进行检索，并结合Sequest检索算法。FT-MS和HCD碎片的搜索参数分别为20 ppm前体离子耐受性和0.1 Da MS/MS片段离子耐受性。该研究允许对半胱氨酸氨基甲基化进行静态修饰，对蛋氨酸氧化、天冬氨酸和谷氨酰胺脱酰胺、n端乙酰化残基和赖氨酸残基上的甘氨酸残基进行可变修饰。两次遗漏的乳沟是允许的。通过Percolator对数据进行处理，以估计错误发现率。蛋白质鉴定采用0.01的q值进行验证。使用基于强度的定量进行无标记定量(LFQ)，使用Proteome Discoverer 2.4中的默认参数，包括用于定量的“独特”肽和“总肽量”归一化。
研究人员分别从悉尼脑库和CIEN组织库获取了两名携带p.S621G或p.S195R突变的ALS患者的颈脊髓组织切片，切片厚度为5μm，经福尔马林固定石蜡包埋。神经正常对照患者颈脊髓组织取自悉尼脑库。根据脑库协议，两家脑库均获得了捐赠脑的知情同意书。病例的人口统计信息列于表1。为了检测p62与泛素之间的相互作用，采用McCann等人，2020[77]中描述的方法进行了双免疫荧光检测。简单地说，用二甲苯对组织切片进行脱烃处理，然后用一系列浓度逐渐降低的乙醇溶液和水再水化。热诱导抗原提取液为10 mM柠檬酸缓冲液，pH为6.0 (Sigma-Aldrich)。用5%正常山羊血清阻断非特异性抗体结合。采用一抗p62(默克MABN130, 1:50稀释)和泛素(Dako Z0458, 1:100稀释)检测p62和泛素，随后采用Alexa Fluor 488和555偶联二抗(1:250稀释)检测。使用NeuroTrace 640/660深红色荧光尼索染色剂(ThermoFisher Scientific N21483)标记神经元。
表1本研究病例的人口学信息
采用ZEISS LSM 880倒置共聚焦激光扫描显微镜，63 ×透镜(NA=1.4)， ZEN Black软件获取脊髓前角区运动神经元的z叠图像。cyclin F患者的至少8个运动神经元被成像，每个对照组的3到4个运动神经元被成像。使用Imaris对图像进行反卷积。
在斐济进行图像分析(ImageJ 1.53t)。自动阈值函数(斐济)应用于每个通道随机选择的三个图像。选取信噪比最佳的阈值应用于所有图像。然后使用手绘选择工具选择神经元来创建感兴趣的区域。最后使用BIOP Just Another Colocalization Plugin (JACoP) http://k1.fpubli.cc/file/upload/202308/14/jf32lq2pycr进行共定位和面积测量。(78、79)。
采用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，p < 0.05为显著性。每个试验至少进行3个生物重复(n≥3)。数据以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。单因素方差分析，使用布朗-福赛对不等方差进行校正，随后使用邓尼特事后比较。显著性阈值设为p=0.05。两个样本(即WT和突变体)之间的比较使用非配对t检验，并对不等方差进行Welch校正。
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