热点;nsored有限公司内容由沃特斯|怀亚特科技思想领袖Kushol Gupta教授宾夕法尼亚大学研究助理教授
在这次采访中，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系研究助理教授Kushol Gupta博士向News-Medical and Life Sciences讲述了光散射技术在他正在进行的HIV整合酶研究和HIV治疗方法开发中对研究结构和作用机制的重要性。
在约翰基金会核心，我们依靠一系列最先进的仪器。我们使用的所有技术结合在一起，相互补充，以提供对结构和功能的更深层次的理解。
光散射测量是我们正在进行的研究的关键促成因素。事实上，我们的工具箱中最受欢迎和最具生产力的工具，是我们的光散射仪器，都是由怀亚特科技公司制造的。其中包括我们的Dynapro纳米星动态光散射(DLS)仪器;我们的SEC-MALS组件，DAWN多角度光散射仪和Optilab折射率检测器耦合到尺寸排除色谱;以及我们最近获得的CG-MALS(成分梯度多角度光散射)仪器Calypso。
在过去的十年里，该团队的许多论文和资助的研究都包含了各种各样的光散射。
MALS直接测量由于生物聚合物的分子质量而产生的光散射水平，从而能够独立测量其在溶液中的性质。由于两个分子之间的大分子相互作用，如蛋白质与蛋白质或蛋白质与核酸，质量和散射光的数量会增加。这种现象可以简单到两个单体形成二聚体，也可以是更复杂的事件，如聚合和蛋白质聚集。
动态光散射，或DLS，测量由分子布朗运动引起的散射光强度的波动。对信号进行分析，以确定平动扩散系数，从而确定分子的大小或流体动力半径。
DLS和MALS已成为生物大分子研究成功的日常先决条件。对于那些使用低温电子显微镜、x射线晶体学或核磁共振等新生技术的人来说，重组制剂的常规分析和批对批验证是成功确定结构的关键步骤。
对于酶学家表征重组制剂的活性和抑制作用，批量验证是准确发现和评估先导靶标的关键。对于像我这样的小角度x射线和中子散射科学家来说，没有这些关键的实验测量，几乎不可能可靠地解释实验结果。
在过去的十年里，我个人在宾夕法尼亚大学进行了数百次SEC-MALS实验，进行了一系列广泛的研究，包括蛋白质-核酸相互作用，RNA剪接背景下的蛋白质-蛋白质相互作用，HIV生物学和药物发现，位点特异性重组和染色质结构。
SEC-MALS是符合多角度光散射的排粒径色谱法。在生物化学和结构生物学研究中，它是光散射最常用的应用之一。
感兴趣的样品通过标准色谱柱，根据其大小分离大分子。分离后的洗脱液进入多角度光散射仪，该仪器每秒记录多个角度的光散射。差示折射率检测器可直接测定各时间点大分子的浓度。
这样就可以根据光散射和浓度数据来确定分子质量，而不需要任何标准曲线或理论消光系数。分析是独立的保留时间和任何假设的构象或柱的相互作用。
艾滋病毒/艾滋病流行病仍然是一个主要的全球公共卫生问题，目前全世界有3 700万人受到感染。预计到2020年将有3000万人接受抗逆转录病毒治疗。然而，由于病毒对当前抗逆转录病毒药物的耐药性的发展，治疗工作受到阻碍，因此需要新的治疗方法。
fda批准的抗HIV药物是链转移抑制剂(STIs)，它阻止HIV DNA整合到宿主基因组中形成原病毒。最新一代的这些化合物现在正在被优化，以抵消新出现的耐药性并改善药物半衰期。
我的主要研究领域是HIV整合酶，它催化链转移。整合酶是HIV基因组编码的三种酶之一。它是一个32千道尔顿的三结构域蛋白质。
重组HIV整合酶蛋白最显著的特征是其自结合和形成低聚物的倾向，这使得其结构难以研究。虽然部分晶体结构是可用的，但全长蛋白多年来一直困扰着全世界的研究人员。
图片来源:Shutterstick /生物医学
在过去的15年中，基于x射线和中子的小角散射技术(SAXS和SANS)在结构生物学和溶液生物物理学中的应用呈指数增长。它们提供了丰富的信息，是我们用来了解分子结构的关键工具之一。
在这些方法中，将x射线或实验中子的柱状光束对准大分子样品，并将散射强度绘制为散射角的函数。
利用傅里叶变换分析，我们可以深入了解分子的形状和空间范围。这些信息可以直接与已知原子结构的轮廓进行比较，以确定溶液中的结构和组成。
然而，如果样品被轻微污染或部分寡聚化，这些结果的解释就会受到很大影响。这就是SEC-MALS的表征和质量控制对小角度散射技术的发展和应用至关重要的地方，因为SAXS和SANS往往涉及昂贵的光束时间和行程。
除其他优点外，SEC-MALS对大聚集体的存在比SEC-UV敏感得多。在440 kDa的乳酸菌乳酸菌II组内含子蛋白- rna复合物中，它检测到紫外线无法检测到的低水平大聚集体。因此，我们进行了额外的纯化步骤，最终实现了SAXS测量和高分辨率低温电镜结构的测定。
SEC-MALS是利用小角x射线散射技术成功研究HIV整合酶宿主因子相互作用的关键。它使我们能够筛选出许多突变和截断形式的重组整合酶复合物，因此我们可以获得感兴趣的复合物的高质量数据。我们在整合酶与宿主晶状体上皮衍生生长因子(LEDGF)相互作用的研究中强调了这一点，LEDGF是病毒生命周期的重要组成部分。
同样，在我们2012年的双焦点研究中，SEC-MALS分析对相关逆转录病毒整合酶蛋白- dna复合物的表征至关重要。我们用SEC-MALS证实，整合酶蛋白结合到病毒DNA末端的化学计量是4个整合酶对2个DNA。SEC-MALS使我们能够优化缓冲条件并限制聚合。
图片来源:伤风/爆炸
绝对的。在我们最近对HIV整合酶与复杂的新型药物ALLINIS相互作用的结构研究中，SEC-MALS和其他技术首次为获得全长蛋白结构提供了必要的突破。这反过来又使我们能够研究由我们的新结构揭示的蛋白质-蛋白质相互作用。
allini是HIV整合酶的强效变构抑制剂，目前正在临床试验中进行评估。它们是通过研究ledgf -整合酶相互作用的晶体结构来确定的。很明显，小分子可以阻断这种相互作用，并在过程的早期阻止HIV复制。
在SEC-MALS的帮助下，我们从整合酶蛋白上获得的结构中确定了LEDGF结合位点，并使用基于结构的设计开发了阻止这种相互作用发生的分子。通过筛选破坏宿主因子LEDGF与整合酶结合的能力来选择潜在的候选药物。
我们的研究重点是两个ALLINIS (GSK1264和GSKOO2)。这两种化合物都有一个共同的连接取代的中心芳香环系统的键。x射线晶体学表明，两者结合在整合酶催化结构域的同一位点上，具有较高的亲和力。
这两种分子都具有强大的后期复制效应，可显著破坏HIV颗粒组织并改变病毒颗粒的形态分布。这与它们独立于温度和浓度催化HIV整合酶聚集的能力有关。SEC-MALS监测了这种聚集，表明这种聚集需要整合酶的催化核心结构域和c端结构域。
我们想知道这些药物是如何在结构层面起作用的。导致药物诱导的整合酶聚集的结构变化是什么?
为了发现这一点，我们需要酶-药物复合物的结构。由于该药物促进了已微溶蛋白的聚集，这不利于获得用于x射线晶体学分析的有序晶格。相反，我们开始使用多角度光散射、分析性超离心、小角度x射线散射(SAX)来表征该复合物的许多点突变，以确定哪些形式的整合酶蛋白对allini的反应较弱。
图片来源:伤风/ Sciencepics
通过SEC-MALS和沉降平衡分析，我们发现整合酶的突变仅以二聚体的形式存在。即使在药物浓度升高时，药物引起的聚合也大大减弱。这是我们第一次能够结晶全长、完整的蛋白质与ALLINI复合物。
我们能够使用分子替代研究模型来解决先前确定的催化核心结构域和c端结构域的结构。广泛的蛋白质-蛋白质相互作用被观察到，没有看到与任何其他整合酶形式。一个二聚体的C端结构域延伸到邻近二聚体的核心结构域，非常类似于一只手抓住一个球。
对ALLINIS产生抗性的整合酶突变分为两类。它们要么直接破坏结合界面，要么扰乱药物定位，使其无法结合。通过引入特异性整合酶突变，我们能够确认我们对这种药物稳定蛋白-蛋白界面的新理解;再一次，使用SEC-MALS来确定低聚物形式，并结合其他技术。
我们进行了一系列SEC-MALS研究，以进一步探索整合酶- allini复合物的结构。最令人惊讶的发现，正如我们的新晶体结构所强调的那样，是预期的聚合和后期复制效应。我们选择并设计allini来中断LEDGF和整合酶之间的蛋白-蛋白相互作用，但我们的研究结果表明，这些药物非常有效地稳定了整合酶的开放聚合物。
这些结果共同为这种刚刚进入临床试验的新型药物的药物设计方法提供了见解。
欲了解更多信息，请访问https://www.wyatt.com/library/webinars/applications-of-light-scattering-to-hiv-integrase-structural-biology-and-drug-discovery.html
Kushol Gupta博士是宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系的研究助理教授。他还担任结构生物学和生物物理学核心约翰逊基金会的董事。
古普塔博士的研究重点是HIV整合酶和靶向这种蛋白质的小分子的抗病毒作用。利用多种生物物理技术，包括x射线晶体学、小角度x射线散射、光散射和分析超离心，可以更深入地了解HIV整合酶的结构和功能，更有效地筛选抗HIV整合酶化合物，并全面了解潜在候选药物的治疗机制。
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